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                    淺談新冠病毒的核酸檢測法


                    • 淺談新冠病毒的核酸檢測法
                      1. 淺談新冠病毒的核酸檢測法

                    淺談新冠病毒的核酸檢測法

                    新型冠狀 病毒的檢測方法主要包含核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測幾種方法。由于抗原檢測檢出率較低,目前新冠檢測主要集中在抗體和核酸檢測。核酸檢測目前是新型冠狀 病毒檢測的“金標準”,具有早期診斷、靈敏度和特異

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                    新型冠狀 病毒的檢測方法主要包含核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測幾種方法。由于抗原檢測檢出率較低,目前新冠檢測主要集中在抗體和核酸檢測。核酸檢測目前是新型冠狀 病毒檢測的“金標準”,具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點;但抗體檢測操作便捷、檢測迅速,可作為核酸診斷的補充手段,但由于抗體檢測“假陽性”和“假陰性”的局限性,不適合用于復工復產復學等普通人群篩查,也不適用于在低流行地區的流行病學調查。

                    檢測原理:

                    所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。新型冠狀 病毒(2019-nCoV)屬于Beta冠狀 病毒屬(Betacoronavirus),該病毒是蛋白包裹的單鏈正鏈RNA病毒,寄生和感染高等動物(包括人)。病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標志物,新型冠狀 病毒出現后,我國科學家已經成功發現了新型冠狀 病毒中的特異性核酸序列。如疑似患者樣本中能檢測到新型冠狀 病毒的特異性核酸序列,則認為該患者可能被新型冠狀 病毒感染。 新型冠狀 病毒常用的核酸診斷方法有兩種:病毒核酸特異基因檢測和病毒基因組測序。較常見的檢測新型冠狀 病毒特異性核酸序列的方法是熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應)。由于新型冠狀 病毒是RNA病毒,試劑盒檢測基本都采用反轉錄加實時聚合酶鏈式反應法(RT-PCR),擴增病原體的核酸 (RNA) ,同時通過熒光探針實時檢測擴增產物。在PCR反應體系中,包含一對特異性引物以及一個Taqman探針,該探針為一段特異性寡核苷酸序列,兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;如反應體系存在靶序列,PCR反應時探針與模板結合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解,報告基團與淬滅基團分離,發出熒光。每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)與病毒核酸濃度有關,病毒核酸濃度越高,Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。

                    由于每個RT-PCR反應需要2個小時左右才出結果,因此,試劑盒在開發時一般都針對病毒序列中高度保守的2-3個序列比如編碼replicase(復制酶)或者necleocapsid(核蛋白衣,核鞘)的核酸序列設計引物,但是各個方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex,也就是把多個目標序列在同一反應管中擴增;另一些采用分步,先用一個目標序列篩查,陽性后再用另一個序列確認,這樣可以有效縮短整個流程時間,加快檢測速度。另外RNA病毒變異很快,用多個保守目標序列可以防止病毒變異造成的假陰性。

                    目前批準產品均基于新型冠狀 病毒基因組中開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein,E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)進行選擇。不同產品的檢測原理基本一致,但是其引物、探針設計存在不同,有單靶區段(ORF1ab)、雙靶區段(ORF1ab、N蛋白)、三靶區段(ORF1ab、N蛋白和E蛋白)的檢測和判讀差別。一般檢測位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個靶標,同一份標本需滿足雙靶標陽性或重復檢測為單靶標陽性或兩種標本同時滿足單靶標才能確認SARS-CoV-2病毒核酸陽性。

                    檢測流程:

                    檢測程序需要經過五個步驟,取樣、留樣、保存、核酸提取、上機檢測。首先根據試劑盒說明書進行樣本采集,樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于RNA易降解,因此,采集樣本時使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲存管。獲得患者樣本后,需盡快進行檢測,如無法立即檢測需要進行低溫封裝,并送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本后,對樣本進行核酸提取,核酸提取試劑應使用批準產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。zui后是熒光PCR核酸檢測,也就是上機器檢測,將提取物進行熒光PCR擴增反應,需要70—80分鐘。

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                    淺談新冠病毒的核酸檢測法 2020-7-22 本文被閱讀 1489 次
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